Estudio De La Estabilidad De La Glucosaoxidasa En Sistemas Amorfos, Compuestos Por Sacarosa, Maltosa Y Trehalosa

(Resumen)

 

La necesidad de buscar nuevos métodos de estabilización y preservación de biomoléculas en la industria farmacéutica y biotecnológica se hace cada día más urgente, esto ocurre debido a que los métodos usados actualmente, no satisfacen del todo las expectativas de calidad y estabilidad durante el almacenaje. La estabilización de las enzimas como bioproductos se realiza actualmente mediante diversas técnicas, siendo una de ellas la liofilización; que es una técnica empleada para la preservación de muchas enzimas simples. Pero esta técnica y la deshidratación en secadores por aspersión tienen sus limitantes, ya que perjudican y disminuyen las actividades de las enzimas oligoméricas e inducen a la pérdida de viabilidad de muchos sistemas biológicos.

La mayoría de los investigadores han asumido equivocadamente que el proceso de secado con aire y la congelación-sublimación (liofilización) son similares. En ambos procesos se remueve el agua, pero la diferencia está en que durante la congelación se logra congelar una parte del agua, aquella denominada agua congelable y es la que se retira durante el proceso de sublimación. En cambio durante el secado una mayor proporción de agua puede ser retirada, no solamente la fracción congelable sino también la no congelable, pudiendo causar mayor daño en los sistemas vivos que pierden rápidamente su viabilidad.

Hemos observado en el laboratorio, que en el proceso de liofilización, gran parte de la actividad de diversas enzimas oligoméricas, tales como la tripsina y la glucosa oxidasa (GOD); se pierde durante dicho proceso. Ahora cuando se evalúa la actividad de la GOD luego del proceso de congelación-descongelación, encontramos la evidencia de que la pérdida de la actividad en gran parte se encuentra centrada en esta etapa de congelación donde se produce una pérdida del 80.2% de la actividad de la GOD. Esto nos indica la imposibilidad de muchas enzimas de soportar el estrés por congelación a diferencia de otras proteínas diseñadas por la naturaleza, que poseen la propiedad de soportar muy bajas temperaturas sin desnaturalizarse.

En función de nuestras observaciones nos hemos centrado en generar un modelo teórico que permita a través de su aplicación, estabilizar las enzimas oligoméricas durante la liofilización; tal modelo se define sobre la base de los estudios realizados en las semillas del desierto de Atacama (SDA), ubicado al norte de Chile. Dicho modelo fue probado en sistemas In vitro, logrando mantener estable la GOD liofilizada. Finalmente las enzimas estabilizadas, fueron aplicadas en biosensores enzimáticos, donde se requiere una buena estabilidad de las enzimas involucradas en el biosensor. El uso de la GOD estabilizada en un sistema amorfo permitió mantener una buena respuesta y alta durabilidad (estabilidad al almacenamiento), de los biosensores enzimáticos evaluados.

El modelo In vitro propuesto, contempla el uso de los disacáridos sacarosa, maltosa, trehalosa y sus respectivas combinaciones en ausencia o presencia de otros agentes tales como los iones calcio, zinc, sodio dodecilsulfato (SDS) como surfactante y el etilen diamino tetraacético (EDTA) como agente secuestrante.

El uso de estos agentes, se debe a su presencia directa o indirecta en las SDA, ellos constituyen factores de relevancia en cuanto a su tolerancia a la desecación. En la SDA denominada Nolana villosa recolectada en una región de casi desierto absoluto, se encontró un 22% base seca (b.s.) de oligosacáridos en la semilla entera, además la cuantificación de los oligosacáridos indica la presencia de una gran cantidad de sacarosa, seguida de otros oligosacáridos como la estaquiosa y rafinosa; todos ellos responsables en gran parte del estado amorfo presente en esta semilla. Se aprecia que el parámetro Temperatura de transición vítrea (Tg) indicativo de la presencia del estado vítreo o estado amorfo formado principalmente por los oligosacáridos, es del orden de 59,8 ºC a una actividad de agua (aw) 0.0. Este factor de los oligosacáridos presentes, la comprobada presencia de las dehidrinas que son proteínas altamente hidrofílicas y el alto nivel de calcio además de otros cationes; sustenta nuestro modelo In vitro y las formulaciones derivadas de los factores involucrados en dicho modelo.

Los resultados de la combinación de sacarosa al 5% P/V y trehalosa al 15% P/V, resultó ser un buen crioprotector de la GOD. También se determinó que la GOD como enzima oligomérica, sufre desnaturalización por efecto de la congelación, pero dicho proceso es reversible dentro del margen de las experiencias de congelación realizadas. Se encontró que en presencia de sacarosa al 5% P/V, se recupera en 120 minutos el 81% de la actividad perdida durante la congelación, ahora cuando se combina sacarosa al 5% P/V y trehalosa al 15% P/V se recupera en 120 minutos el 97% de la actividad inicial de la GOD. Pero al combinar la sacarosa al 5% P/V, la trehalosa al 5% P/V y el EDTA al 1% P/V como agente secuestrante, se logra recuperar en 60 minutos; el 99.7% de la actividad inicial de la GOD perdida durante la congelación. Esto indica que la combinación de los disacáridos antes mencionados en conjunto con el agente secuestrante, constituyen una mezcla crioprotectora de gran valor para la GOD.

La estabilidad de la GOD liofilizada en presencia de los disacáridos sacarosa 5% P/V y trehalosa 10% P/V ejerce una acción combinada como crioprotector y como lioprotector, esto se refleja en la constante de inactivación térmica de la GOD KD a una aw de 0.0 y a temperaturas de 30, 50 y 70 ºC. La presencia de calcio y zinc al 1.92 % P/V en estos sistemas formados por los disacáridos sacarosa y trehalosa, no ofrecen una protección adicional de la enzima cuando es sometida al efecto térmico en el estado amorfo. Los sistemas donde están presentes sacarosa 5% P/V, trehalosa al 15% P/V, Zinc y EDTA al 1% P/V a una aw de 0.44 valor máximo posible para mantener el sistema amorfo, ejercen un efecto crioprotector y lioprotector excepcional, mantiene estable la actividad de la GOD en su valor inicial a pesar del tratamiento a las diferentes temperaturas de 30, 50 y 70 ºC.

La GOD estabilizada en sistemas amorfos sencillos formados por maltosa al 5% P/V, fue utilizada en biosensores tipo compositum diseñados para una aplicación de la misma en medición de glucosa, los resultados indican que el biosensor que contiene la enzima en sistemas amorfos, se mantuvo más estable que el biosensor sin tratamiento con maltosa. A los 21 días el biosensor de control (sin tratamiento) arrojó una carga promedio de 126.7 µC y el tratado una carga de 638 µC. Biosensores preparados con trehalosa al 5% P/V fueron comparados con un control sin presencia de trehalosa, este demostró que a los 5 días mantenía una sensibilidad mayor que el control, los valores de la carga del biosensor tratado a los 5 días fue de 311.5 µC y el control de 267.4 µC. Para demostrar que la estabilización y su aplicación son extensibles a otras enzimas oligoméricas, se probó con un biosensor de colesterol. Las enzimas involucradas fueron tratadas con sacarosa y trehalosa al 5% P/V cada uno. La sensibilidad  del biosensor con tratamiento resultó del orden de 330.56 µA/ml mayor que la sensibilidad del biosensor control que fue de 262.54 µA/ml  colesterol añadido al sistema. Las pruebas de durabilidad hecho durante un lapso de 9 días indica que la corriente difusional Id se mantiene constante en función del tiempo, esto refleja de que la enzima se mantiene bastante estable en el tiempo; en cambio el biosensor de control (sin tratamiento) presenta un decaimiento pronunciado en la corriente difusional, que debe ser directamente proporcional a la concentración del sustrato en el electrolito de soporte; esto indica la inactivación de la enzima sin tratamiento.

En conclusión, las enzimas oligómericas (en este caso GOD) inmovilizadas en sistemas amorfos presentan una buena estabilidad para ser usadas en muchas aplicaciones; no solo en biosensores sino también en el campo farmacéutico donde la estabilidad de las enzimas, bioproductos o principios activos inmovilizados en la matriz amorfa, pueden jugar un papel importante en medicamentos que tendrían la factibilidad de ser suministrados sin perder su concentración y además podrían ser almacenados y distribuidos en la cadena de comercialización sin sufrir deterioro en amplias condiciones de  almacenaje.

 

Autor: Ing. Hans Leroy M. Valenzuela Delphin